Enzymy jsou sloučeniny, které svým působením umožňují a usnadňují průběh biochemických reakcí.
Enzymy proteinické (jednosložkové) jsou složeny jen z bílkoviny, na které je vytvořeno v určitém místě z několika aminokyselin aktivní centrum, které určuje specifitu enzymu (tj. reakcí jakých látěk se bude zúčastňovat).
Na druhé straně specifičnost účinku enzymu (tj. Enzymů, které zprostředkovávají biochemické reakce v rostlinném i živočišném světě, jsou tisíce, neboť může docházet i k různým kombinacím apoenzymů a koenzymů.
Enzymy mají určitou substrátovou specifitu.
Přeměňuje-li enzym více různých substrátů, má ke každému substrátu různou afinitu.
Pokud mohou stejný substrát přeměňovat např. dva různé enzymy, každý z nich má k danému substrátu jinou afinitu.
Disociační konstanta Km se v tomto vztahu nazývá konstanta Michaelis-Mentenové a fyzikálně se rovná koncentraci substrátu, při níž rychlost enzymatické reakce dosahuje právě 1/2 maximální rychlosti Vmax.
Číselná hodnota konstanty Km vyjadřuje afinitu enzymu k danému substrátu, tj. malé hodnoty této konstanty znamenají, že enzym je vysoce specifický k danému substrátu a je aktivní již při malých koncentracích tohoto substrátu.
Jak vyplývá z teorie enzymatických reakcí, většina biochemických reakcí probíhajících v omezených okrajových podmínkách (zejména v malém rozsahu teplot) musí být katalyzována těmito biokatalyzátory, jinak by nemohla probíhat s technologicky přijatelnými rychlostmi.
Mikrobiální konsorcia používaná při biologickém čištění odpadních vod jsou samovolně vzniklá a dlouhodobě adaptována na příslušné vnější podmínky, tj. zejména na teplotu a chemické složení média - odpadní vody.
Proto by i za normálních podmínek měla být rozmanitost i koncentrace enzymů produkovaná takovým konsorciem jako je např. mikroorganismy produkující příslušné enzymy nejsou v konsorciu přítomny; důvodem může být nevhodnost podmínek pro jejich růst, např. příliš nízká teplota, extrémní pH, nedostatek rozpuštěného kyslíku ale i např. daný substrát se může v odpadní vodě vyskytovat jen nárazově s krátkou periodou trvání jeho výskytu, což může vyvolávat problémy s účinností induktivních enzymů.
V takovýchto případech je i účelné uvažovat o umělém přidávání těch enzymů, jejichž koncentrace jsou z nejrůznějších důvodů v aktivační směsi nedostatečné.
Nutno ovšem předem pečlivě vyloučit inhibiční vlivy.
Jedním z nejcitlivějších procesů při současném biologickém čištění odpadních vod je biologická oxidace amoniakálního dusíku na dusík dusičnanový - nitrifikace.
Zde se může jednat o dávkování specifických enzymů podporujících některý z kroků přenosu elektronů z amoniakálního dusíku na rozpuštěný molekulární kyslík.
Proces nitrifikace je také často limitován nedostatečnou koncentrací rozpuštěného kyslíku v biomase, která se pohybuje pod hodnotou saturační koncentrace pro kyslík.
V konsorciu aktivovaného kalu se může vyskytovat mnoho mikroorganismů, které mají vláknitou morfologii.
Výskyt mikroorganismů v této formě vede ke zhoršení sedimentačních a i zahušťovacích vlastností aktivovaných kalů (jev známý jako vláknité bytnění aktivovaného kalu).
Většina vláknitých mikroorganismů způsobujících tento problém preferuje jako substráty jednodušší cukry, které mohou být produktem rozkladu polysacharidů.
K problémům dochází tehdy, jestliže produkty tohoto rozkladu jsou uvolňovány do media ve velkých objemech aeračních nádrží a nikoli v kompartmentech kontaktních zón, které jsou za účelem prevence vláknitého bytnění do aktivačních systémů vkládány.
Urychlení rozkladu polymerních sloučenin a využití produktů jejich rozkladu ještě v kontaktní zóně by bylo možné dosáhnout přídavkem specifických štěpících enzymů, např.
Problém zvýšené tvorby biologických pěn je aktuálním problémem našich aktivačních ČOV v posledních cca 15 letech.
Systematický výzkum prováděný v ČR na VŠCHT Praha ve spolupráci s předními zahraničními pracovišti potvrdil, že bezprostřední příčinou tvorby biologických pěn je opět zvýšený výskyt vláknitých mikroorganismů, tentokráte ovšem jiných druhů.
vysoká afinita k substrátům typu tuky či oleje a nebo k prvním produktům jejich štěpení, tj. Dominantní část ostatních mikroorganismů aktivovaných kalů (tzv. vločkotvorných) není schopna utilizovat tuky či dlouhé mastné kyseliny přímo.
Podpořit růst těchto vločkotvorných mikroorganismů na úkor pěnotvorných vláken může přídavek enzymů, které urychlují hydrolýzu tuků (tj. rozrušují vazbu glycerol - dlouhá mastná kyselina C16-C18) a zároveň podporují štěpení C-C vazeb a tudíž rozklad dlouhých mastných kyselin na tzv. těkavé mastné kyseliny s uhlíkovými řetězci C2-C6.
Možnost zvýšené biologické rozložitelnosti tzv. Odtok z biologických čistíren odpadních vod obsahuje tzv. refraktorní neboli zbytkové organické látky, které pocházejí částečně ze špatně biologicky rozložitelných podílů organického znečištění surových odpadních vod, částečně jsou produkovány metabolismem mikroorganismů tvořících biologická konsorcia v čistírnách odpadních vod.
Příčin špatné biologické rozložitelnosti této skupiny organických látek je celá řada, nicméně jednou z nich může být i nedostatečná koncentrace enzymů např. ze skupiny lyáz, iniciujících štěpení organických vazeb C-C.
Zvýšení koncentrace těchto enzymů zvýší i pravděpodobnost těchto interakcí a může initiovat štěpení tohoto typu látek.
Byla provedena izolace a identifikace mikroorganismů produkujících depolymerizační enzymy vybraných polymerů.
Zdrojem zmíněných mikroorganismů byly vzorky kompostů, které byly naočkovány na kultivační půdy obsahující polyestery PBAT nebo PLA.
Celkem bylo zkoumáno 5 vzorků kompostu, které byly dále charakterizovány dostupnými fyzikálně‑chemickými vlastnostmi jako je pH, sušina a spalitelný podíl.
Ze vzorků kompostů byla prováděna izolace bakterií schopných tvořit zóny hydrolyzovaného polymeru kolem svých kolonií, což bylo považováno za důkaz produkce extracelulárních depolymerizačních enzymů.
V případě kultivační půdy s obsahem PLA nebyly zóny pozorovány, tudíž nebyla izolována žádná bakteriální kultura hydrolyzující PLA.
Naopak v případě kultivační půdy s obsahem PBAT byly izolovány čtyři bakteriální kmeny, později identifikovány jako blízce příbuzné kmenům Actinomadura rubrobrunea DSM 43750, Thermobispora bispora DSM 43833 a Thermomonospora curvata DSM 43183.
Pro identifikaci izolovaných bakterií byla použita metoda sekvenace genu 16S rRNA, byla izolována DNA mikroorganismu a po purifikaci vzorku byl tento odeslán k sekvenaci.
Enzymy mohou být důležité pro rozklad tuků a dalších polymerů v odpadních vodách, což může zlepšit nitrifikaci a snižovat tvorbu pěn.
Enzymy jsou sloučeny s různými koenzymy a apoenzymy a jejich aktivita a koncentrace v buňce jsou řízeny komplexní regulací.
Aktivita enzymů je ovlivňována změnami pH, teploty a množstvím substrátu.
Aktivátory a inhibitory modulují konformaci enzymu a tím mění afinitu k substrátu a rychlost reakce.
Allosterická regulace se vyskytuje u enzymů složených z více podjednotek a modulátory se vážou na místa mimo aktivní centrum.
Aktivátor mění T‑formu enzymu na R‑formu, čímž zvyšuje aktivitu enzymu.
Substráty a efektory obecně pouze ovlivňují rovnováhu mezi konformacemi T a R - obě konformace existují vedle sebe v různých poměrech.
Konečné množství aktivních forem enzymu záleží na celkovém účinku různých aktivátorů a inhibitorů vázajících se na enzym, tj. závisí na jejich vzájemném poměru v buňce.
Při zvýšení KM může být za fyziologických podmínek reakce úplně vyřazena, neboť fyziologická koncentrace substrátu leží v oblasti, kde je enzym prakticky neúčinný.
Enzymové procesy v průmyslu často vyžadují stabilizaci a úpravu formulací bez glycerolu, zejména pro lyofilizaci a ambientní stabilitu.
Historicky se glycerol používá jako ochranné činidlo v enzymových poléch a baterií, ale existují výzvy při jeho odstraňování a udržení aktivity enzymu po lyofilizaci.
Meridian má zkušenosti s vyvíjením glycerol‑free enzymů pro PCR, LAMP a NGS a nabízí také formulace na míru pro konverzi stávajících enzymových formulací na glycerol‑free verze.
Kritickým prvním krokem při tvorbě glycerol‑free enzymu je použití vysoce čistého materiálu, což se dosahuje pečlivou purifikací a přísnou kontrolou kvality.
V rámci testů odolnosti glycerol‑free Taq HS 50U/μL (MDX011) proti mrazu a rozmrazení byl proveden test s 10 a 15 cykly mrazení/rozmrazení a porovnán s čerstvým produktem (0 cyklů).
Výsledky ukazují, že glycerol‑free formulace mohou nabídnout lepší stabilitu a výkon po lyofilizaci i při ambientních teplotních podmínkách bez nutnosti přísunu chladu.
Další výzkumy ukazují potřebu vybrat vhodné stabilizátory a excipienty, které chrání strukturu a aktivitu enzymu bez narušení následných aplikací.
V souladu s potravinářskou a biotechnologickou praxí je glycerol často nahrazen jinými přísadami, které zajišťují stabilitu a kompatibilitu s průmyslovými procesy.
Podstatou je vyřešit rovnováhu mezi kryogenní ochranou a zachováním funkčnosti enzymu, aby byl zajištěn spolehlivý výkon v reálných podmínkách.
1. Glycerol as an Enzyme-Stabilizing Agent: Effects on aldehyde dehydrogenase. (1972). In Proc. Natl. Acad. Sci. USA...
2. Vagenende, V., et al. (2009). Mechanisms of protein stabilization and prevention of protein aggregation by glycerol. Biochemistry...
3. Braham, S. A., et. (2021). Positive effect of glycerol on the stability of immobilized enzymes: Is it a universal fact? Process Biochemistry...
4. Randolph, T. W. (1997). Phase Separation of Excipients during Lyophilization: Effects on Protein Stability. Journal of Pharmaceutical Sciences...
5. Franks, F. (1993). Storage stabilization of proteins. In Humana Press eBooks...