Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Samotné izolaci předchází příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. V této práci jsou plasmidy CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1. nejprve amplifikovány v bakteriích E.Coli kmenu DH5 a poté metodou fenol-chloroformové extrakce izolovány. K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293.
The isolation of plasmid DNA is an important and often used method in microbiology. The isolation itself is preceded by preparation of bacterial competent cells and by amplification of the plasmids. In this stage, plasmids CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 and Kir2.1. are first amplified in E.Coli bacteria of the DH5 strain and then isolated through the method of phenol-chloroform extraction.
Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Samotné izolaci předchází příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. V této práci jsou plasmidy CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1. nejprve amplifikovány v bakteriích E.Coli kmenu DH5 a poté metodou fenol-chloroformové extrakce izolovány. K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293.
Proč je důležitá kvalita DNA a jak ji zajišťují základní kroky
Proč je důležitá kvalitní DNA. Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitors polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.
Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů.
Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Metody izolace DNA
Mezi hlavní metody izolace DNA patří fenol-chloroformová extrakce, extrakce pomocí silikátové pevné fáze a magnetická separace. Každá z těchto metod má své výhody a nevýhody, které ovlivňují výtěžek a čistotu izolované DNA.
Fenol-chloroformová extrakce
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin.
Postup fenol-chloroformové extrakce: Homogenizace tkáně a lýza buněk: Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Denaturace a vysrážení bílkovin: Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Vysrážení DNA: Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která vysráží DNA. Promývání a rozpuštění DNA: Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Nevýhody fenol-chloroformové metody: Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje.
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze
Tato metoda využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku.
Hodnocení izolace a následné kroky
K určení správnosti izolace slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293. Tyto kroky potvrzují, že izolovaná plasmidová DNA je kompletní a funkční pro další analýzy.
Plasmids Explained: The Tiny DNA That Makes Antibiotics Fail 🧬
Tabulka: shrnutí metod a jejich charakteristik
| Metoda | Klady | Zápory | Výtěžek |
|---|---|---|---|
| Fenol-chloroformová extrakce | Vysoký čistot | Časově náročná, nebezpečné chemikálie | Vysoký |
| Silikátová extrakce | Jednoduchá, vhodná pro automatizaci | Atypické kontaminanty při špatném pH | Střední až vysoký |
| Magnetická separace | Dobrá pro automatizaci, konkurenceschopný výtěžek | Možná menší objem izolované DNA | Vysoký, opakovatelný |
Izolace plasmidové DNA je tedy komplexní proces, který vyžaduje volbu vhodné metody v závislosti na požadavcích na čistotu a množství DNA, stejně jako na dostupnosti vybavení a bezpečnostních aspektů.