Způsoby izolace mikroorganismů z potravinových vzorků a srovnání jejich médií

Izolace z živné půdy je klíčovým procesem v mikrobiologii, který umožňuje studium a identifikaci mikroorganismů. Živné půdy jsou substráty poskytující vhodné životní podmínky pro růst mikroorganismů.

Typy živných půd

Existuje několik typů živných půd, které se liší svým složením a účelem:

• Tekuté půdy - neobsahují ztužující látky, po celou dobu kultivace jsou tekuté a mohou být definovanou směsí organických a anorganických sloučenin či hydrolyzáty přírodních materiálů. Růst se projeví zákalem, sedimentem nebo blankou na povrchu média. Růstové typy se mohou kombinovat, např. kmen roste v zákalu a současně vytváří sediment.
• Pevné půdy - obsahují ztužující složku, nejčastěji agar v koncentraci 15-30 g na 1 litr média. Agar je polysacharid získávaný z mořských řas rodu Gelidium; dnes i z dalších druhů.
• Speciální typy půd:
  • Obohacené půdy - bohaté na živiny a růstové faktory (aminokyseliny, vitaminy, cukry), např. krevní agar obohacený o hemin pro Haemophilus influenzae.
  • Selektivní půdy - umožňují růst jen určitého druhu díky bakteriocidním látkám nebo naopak chudému na látky nezbytné pro nežádoucí organismy.
  • Diagnostické půdy - slouží k rozlišení více druhů na jednom médiu na základě rozdílů v zabarvení kolonií.
  • Selektivně-diagnostické půdy - kombinace selektivních a diagnostických vlastností.
  • Transportní půdy - slouží k přepravě vzorku do laboratoře s minimem živin, aby nedošlo k přemnožení.
• Chromogenní média - chromogenní půdy s barevným substrátem specifickým pro dané bakterie (např. pro Staphylococcus aureus či E. coli). Často doplněno enzymy pro rychlou identifikaci.

Chromogenní média jsou často validována dle ISO 16140 a umožňují značně zkrátit dobu analýzy díky specifické barvě kolonií spojené s metabolickými aktivitami baktérií.

Očkování mikroorganismů

Očkování (inokulace) mikroorganismů je aseptické přenesení do nového sterilního živného prostředí, aby nevnikly cizí organismy. Inokulum jsou přenesené mikroorganismy. Očkujeme v prostředí zbaveném mikroorganismů, nejčastěji v očkovacím boxu, a postupujeme rychle, zalesněně a co nejpřesněji.

Očkování na pevné půdy

Očkování na pevné půdy má za cíle izolaci mikroorganismů, přípravu čistých kultur, zakládání kultur pro důkaz a diagnostiku. Očkuje se zaléváním do tuhých agarových půd (přelivem) a různými technikami - křížovým roztěrem pro izolaci čistých kolonií, šikmým očkováním ve zkumavkách a dalšími způsoby. Při očkování vpichujeme kulturu do svislého sloupce agaru přibližně 0,5 cm nad dno zkumavky. Důležité je zachovat aseptické podmínky a ožehnout kličku před i po očkování.

Očkování do tekutých a pevně ztužených půd

Očkování do tekutých půd - může být provedeno pipetou, kličkou či MPN metodou (Most Probable Number). Při očkování tekutých vzorků používáme např. 1 ml vzorku. Pro očkování do tekutých půd lze využít i metody MPN pro stanovení pravděpodobného počtu mikroorganismů ve vzorku s nízkým výskytem.

Očkování zalitím do tekuté půdy vyžaduje uvedení vzorku do rozehřáté agarové vrstvy po natáčení. Objem inokula bývá 1 ml, vzorek se rozmíchá a inkubuje.

Detekce a kvantifikace mikroorganismů

Kromě klasických kultivačních metod existují rychlé mikrobiologické metody pro detekci a kvantifikaci bakterií - klíčové pro monitorování kvality v potravinářství.

1. Chromogenní a fluorogenní živné půdy - chromogenní médium, které zobrazuje kolonii barevně (např. Salmon-Gal pro koliformní bakterie a MUG pro glukuronidázu u E. coli). Fluorogenní půdy používají substráty pro enzymy s fluorescencí po UV osvětlení.
2. Imunochemické metody - ELISA, RIA, FIA a další pro detekci antigenů či protilátek; v potravinářství se používají pro detekci salmonely, listerií, kampylobakterů a toxinů.
3. Fluorescenční metody - ELFA, VIDAS systémy pro detekci patogenů a toxinů s fluorescence měřenou fotometrickým zařízením.
4. Průtoková cytometrie - umožňuje rychlé měření a třídění částic na základě průtoku vzorkem a fluorescenčním značením protilátek.
5. Imunomagnetická separace - IMS; bakterie se váží na magnetické částice s imobilizovanými protilátkami a lze je selektivně izolovat.
6. Polymerázová řetězová reakce (PCR) - identifikace na základě DNA; rychlá a vysoce citlivá metoda pro identifikaci patogenů (např. Salmonella, Listeria, E. coli, Staphylococcus aureus, Campylobacter).
7. Bioluminiscenční metody - měření ATP ve vzorcích k odhadu počtu buněk a kontaminace; luminometrie vyhodnocuje RLUs.
8. Imunochemické a fluorescenční metody - ELISA/ELFA s různými markéry a přístroji pro detekci antigenů či protilátek.
9. Imunomagnetická separace - IMS jako metoda předzpracování vzorku pro následnou detekci.

Příprava vzorků a medií

Správná příprava vzorků a médií je klíčová pro spolehlivé výsledky. Pro Legionella spp. a Legionella pneumophila se používají média dle ISO 11731 (GVPC, BCYE, krevní agar) s identifikací podle latexových testů; novější alternativní médium MWY je určeno pro vysoce kontaminované vody. Detekce na místě může být rychlá až během 30 sekund.

Podrobnosti o kvantifikaci uvádí tabulky pro různé výrobky, kde se uvádí počet cfu na jednotku vzorku a povolené limity. Pro různé potravinářské kategorie jsou definovány tolerované hodnoty a nejvyšší mezní hodnoty pro koliformní bakterie, E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus a plísně.

Příprava a použití specifických médií

Nové a specializované půdy a média, včetně chromogenních médií a petrifilmů, umožňují rychlé a přesné stanovení různých skupin mikroorganismů a jejich koncentrací v potravinách a prostředí potravinářských provozů. Petrifilmy umožňují např. stanovení celkového počtu mikroorganismů, Enterobacteriaceae, koliformních bakterií, E. coli, Staphylococcus aureus, Listeria spp. a dalších.

Speciální postupy pro očkování a izolaci z kompostů ukazují, že do PBAT PLA půd nebyly pozorovány zóny hydrolyzace PLA, zatímco PBAT půdy vedly k izolaci čtyř bakteriálních kmenů; identifikace proběhla sekvenováním 16S rRNA. Takové případy ilustrují význam gradientní a gradientně-disperzní techniky pro izolaci specifických subpopulací.

Praktický nástin rutinního postupu izolace na pevné půdě

Při očkování na Petriho miskách se nejprve naředí vzorek a naočkuje na povrch agarové půdy. Poté se agar ztuhne a vzorek se rozdělí na jednotlivé kolonie při křížovém roztěru, s důkladným vyžíháním očkovací kličky mezi kroky. Při očkování na šikmý agar se postupuje tak, že kulturu a čerstvou živnou půdu držíme nad sebou a provádíme očkování kličkou mezi zkumavkami. Po očkování a uzavření zkumavek se zkumavky ošetřují teplem a ze všech stran v dávkách, aby se zabránilo kontaminaci.

Další poznámky

Ochrana před kontaminací, správná volba médií a polohování vzorků jsou klíčové pro spolehlivost výsledků. Správně zvolená média a postupy umožňují izolovat cílové mikroorganismy, identifikovat je a provádět následnou diagnostiku a kvantifikaci.

tags: #zpusoby #izolace #mikroorganismu #z #potravinovych #vzorku