Prime metody stanoveni viru izolace viru

Viry jsou malé, nebuněčné organismy, které obsahují jen jediný typ nukleové kyseliny a replikují se pouze v živých buňkách za využití hostitelské proteosyntézy. Vyznačují se vysokou druhovou a orgánovou specifitou. Rozlišujeme viry rostlinné, živočišné a bakteriofágy, které napadají bakterie. Některé viry se významně podílejí i na vzniku neoplázií, označujeme je onkoviry. Viry mohou být vektory přenášející genetické informace mezi buňkami.

Prvním, kdo experimentálně přenesl virové onemocnění, byl v letech 1879-1882 A. Mayer, který se zabýval mozaikovou chorobou tabáku. Podařilo se mu prokázat, že šťávou z rozetřených listů se dá onemocnění přenést na listy zdravé. Protože se mu z infekčního extraktu nepodařilo vypěstovat žádnou bakterii, domníval se, že původcem je „enzymu podobné kontagium“. Na jeho práci navázal D. Ivanovskij, kterému se v roce 1892 podařilo prokázat, že šťáva z nakažených listů zůstává infekční i po filtraci přes bakteriologické filtry. Mayerův spolupracovník M. W. Beijerinck prokázal, že naředěná šťáva po filtraci získá svoji původní „sílu“ po pomnožení v živé rostlinné tkáni.

Většina virů vznikala a vyvíjela se paralelně s primitivními buňkami. Pravděpodobně už první RNA se vyvíjela ve dvou liniích: virové a buněčné. Ostatní viry pravděpodobně vznikly z buněčného materiálu, který nabyl schopnost částečně nezávislé existence. Osamostatnění RNA molekuly, která kóduje RNA-polymerázu a ke které se přidal gen pro proteinový obal, mohlo stát na počátku vzniku RNA virů. Vznik DNA virů byl pravděpodobně na podkladu osamostatnění transpozonů nebo z primitivní buňky, ve které DNA nebyla ještě organizována do chromozomů.

Virion je termín užívaný pro jednu virovou částici. Jsou to tělíska různého tvaru - kulovitá, tyčinkovitá, vláknitá. Vnitřní část virionu se nazývá nukleoid. Kapsida je složená z proteinových podjednotek - kapsomer. Jejich tvar umožňuje, aby se vzájemně přikládaly a vytvořily větší celek. S ohledem na typ symetrie rozlišujeme dvě hlavní skupiny kapsidy: kubické a spirální (helikoidální). Celek se nazývá nukleokapsida. Nejjednodušší viriony jsou pouze holé nukleokapsidy. Kapsidy s kubickou symetrií tvoří dvacetistěn. Kapsidy se spirální symetrií lze těžko odlišit od nukleoidu a proto hovoříme o nukleokapsidě, která je složena ze šroubovice nukleové kyseliny s kapsomery.

Viry s komplexní symetrií zahrnují bičíkaté bakteriofágy, kde hlavička je kubické a bičík podle binální. Poxviry, největší živočišné viry, mají nukleoid tvaru oboustranně promáčknutého disku. U převážné většiny virů je složen ze zevního lipoproteinového komplexu a z druhově specifického vnitřního proteinu (M-protein). Lipoproteinový komplex tvoří lipidová dvojvrstva a virové glykoproteiny. Tyto glykoproteiny se skládají v peplomery, které obvykle vyčnívají z virového obalu a usnadňují adsorpci na hostitelskou buňku.

Viry obalené mají kolem kapsidy lipidovou membránu. Největší viry (poxviry) měří okolo 300 nm, chřipku vyvolávající viry asi 100 nm. Genom viru je tvořen jednou molekulou nukleové kyseliny (DNA nebo RNA). Nukleová kyselina je nositelem informace pro sebereplikaci a infekčnost. Oba typy NK se mohou vyskytovat jako dsDNA, dsRNA, ssDNA, ssRNA a „chromozom“ může být lineární či cirkulární. Množství NK je různorodé; DNA poxvirů by mohla kódovat syntézu sta proteinů, RNA pikornavirů jen čtyř.

Po vstupu do vnímavé buňky viry zahajují reprodukční cyklus. Pro svoji reprodukci využívají transkripční a translační aparát hostitelské buňky. Vnímavá buňka je ta, ve které proběhne kompletní reprodukční cyklus a uvolní se nové infekční viriony. Děj může proběhnout pod obrazem intracelulární infekce. Viry jsou v hostitelské buňce pomnoženy a lyzují ji; uvolněné viriony napadají další buňky. To se nazývá lytický cyklus. Někdy se NK po vniku viru nereplikují a nevytvářejí zralé viriony. Genom viru se může začlenit do genomu hostitelské buňky a replikuje se s ní. To nazýváme lyzogenní cyklus. Je-li DNA viru integrována do chromozomu hostitele, nazýváme ji provirus. Při směsných infekcích může docházet k rekombinaci genetické informace.

Rozlišovací znakem virů je povaha hostitele. Podle tohoto kritéria existují viry bakterií (bakteriofágy), prvoků, viry kvasinek a plísní, rostlin, hmyzu a obratlovců. V genové terapii je cílem vnášení genu do buňky pomocí virů, které se dokáží začlenit do genomu hostitele (např. adenoviry). Vakcíny se připravují z neinfekčních nebo oslabených virů, například hepatitidy A. Bakulovirus se používá i pro tvorbu proteinů. Hlavní činností virologie je diagnostika infekcí způsobených viry, ale i některými bakteriemi, a spolupráce s mezinárodními institucemi. Laboratoře provádějí různé metody včetně virus isolation a PCR.

V oblasti izolace virů a jejich purifikace jsou uvedeny postupy jako ultracentrifugace, isopycnic density centrifugace, chromatografie a nanofiltrace. Ultracentrifugace využívá viskózní kapaliny, která pomáhá řídit migraci částic a dosáhnout vyšší čistoty. Chromatografie se používá pro obalené i neobalené viry; například závislost na velikosti a typu kolony. Nanofiltrace je membránová separace s velmi malými póry pro envelopované i neobalené viry a je častější v purifikaci plazmových produktů a virů jako hepatitida B a C. Tyto metody umožňují zvyšovat čistotu virů a připravovat vakcíny a diagnostické látky.

Infograficky lze shrnout: virion = nukleová kyselina + kapsida; obalené viry mají lipidovou membránu; hlavní typy kapsidy jsou ikozohedrální a helikoidální; replikace probíhá v hostitelské buňce; lytický a lyzogenní cyklus; viriooborové a terapeutické využití zahrnují genovou terapii a vakcíny.

Obr. 5. Schéma replikace viru. Brána vstupu pro konkrétní druhy virů je specifická a určuje tropismus a patologii. Viry mohou být izolovány v různých biologických vzorcích a za různých podmínek, které ovlivňují rychlost a kvalitu izolace. Pro laboratorní diagnostiku a výzkum je klíčové správné zhodnocení vzorků, metod a biosafety úrovní.

schematická stavba viru a virionu

Virová replikace: lytická vs. lysogenní | Buňky | MCAT | Khan Academy

tags: #prime #metody #stanoveni #viru #izolace #viru