Současná izolace DNA a RNA ze vzorků fixovaných formalínem a zalitých v parafinu (FFPE) umožňuje analytické využití archivních tkání pro genetické a molekulárně biologické studie i přes jejich původní určení pouze pro histologii. Vzorky FFPE se běžně používají pro přípravu histologických preparátů a pro imunohistochemii, které vizualizují specifické molekuly. Právě díky moderním postupům lze tyto vzorky izolovat a analyzovat DNA a RNA, ačkoliv jejich kvalita bývá nižší vzhledem k degradaci a kontaminaci.
Náhlédnutí do praxe ukazuje, že deparafinace a následná izolace DNA i RNA z FFPE tkání umožňuje získat materiál, který by jinak byl nedostupný - zejména genomová DNA z archiva. Výhody spočívají v dostupnosti vzorků z dlouhodobé archivace, nevýhody pak v fragmentaci DNA aRNA, nižším výtěžku a nutnosti upravit následné analýzy. V dalších částech se zobrazují konkrétní kroky a metody izolace na různých vzorcích, včetně nádorových tkání a krve.
Začátek izolace nukleových kyselin z FFPE tkání
Prvním krokem izolace NA je příprava řezů cílové tkáně. Většinou připravujeme řezy dle hematoxylin-eosinových preparátů s vyznačenou oblastí, ze které budeme NA izolovat. Na mikrotomu nakrájíme několik řezů, které odstraníme (svrchní oxidovaná vrstva obsahuje nejvíce degradované NA). Následně připravíme 10-20 µm silné řezy o celkové velikosti přibližně 12×12 mm, ze kterých budeme izolovat DNA a RNA. Dále před vlastní izolací NA provedeme deparafinaci tkáně.
Diplomová práce zkoumala izolaci DNA třemi metodami: fenolovou extrakcí, vysolováním chloridem sodným a magnetickou separací využívající reversibilní adsorpci nukleových kyselin na různé magnetické nosiče. Bylo použito pět nosičů: magnetického silikagelu, P(HEMA-co-GMA) ox. I, P(HEMA-co-GMA) ox. II, Dynal DNA Direct a Perovskit 439. Reverzibilní imobilizace DNA probíhala v prostředí vysoké koncentrace NaCl a PEG; k navázání DNA na magnetické nosiče bylo použito kondenzace DNA pomocí 2 M NaCl a PEG o molekulové hmotnosti 6000, s výslednou koncentrací PEG 8-16 % v separační směsi. Cílem bylo získat DNA kvalitní pro PCR a molekulární analýzy.
Magnetická separace a automatizace v izolacích DNA
Magnetická separace s využitím magnetických mikročástic byla ověřena pro izolaci DNA z probiotických bakterií a fermentovaných mléčných výrobků, kde po izolaci probíhala PCR a analýza gelovou elektroforézou. K inventáži technik patří rovněž automatizované systémy MagCore a Magia 12 DSX, které umožňují rychlou a opakovatelnou izolaci nukleových kyselin z různých vzorků. Tyto systémy pracují na principu adsorpce NA na magnetické částice, vyvázání do elučního pufru a využívání jednorázových náplní pro minimalizaci kontaminace a zvýšení reproducibility.
- Izolace DNA z FFPE tkání tradičními i moderními metodami (fenolová extrakce, solný výlom, magnetická separace).
- Příprava řezů a deparafinace před samotnou izolací NA.
- Separační principy na magnetických nosičích a jejich navázání na DNA pomocí NaCl a PEG.
- Ověření kvality a čistoty DNA měřením Abs260/280 a PCR analýzou.
- Automatizace procesu pro vyšší průchod vzorků a konzistenci výsledků.
Izolace RNA z FFPE tkání a její omezení
Podobně jako DNA lze získat i RNA z FFPE tkání, avšak RNA je často fragmentovaná a náchylná k degradaci, což omezuje následné analýzy. Vzorky představují hodnotný materiál pro celkové RNA, avšak s nutností přizpůsobit metody tak, aby byla zajištěna co nejvyšší kvalita pro další kroky, jako je RT a metody sekvenování. Výhodou je přístup k archivovaným vzorkům, nevýhodou degradace RNA a nižší čistota vzorků.
Instruktážní video ukazuje izolaci RNA z FFPE tkáně deparafinované a připravené k dalším analýzám, včetně identifikace RNA s určitou expresí genů souvisejících s nádory, pokud je to relevantní pro cílové studie.
Detekce cirkulujících nádorových buněk (CTCs) a jejich molekulární analýzy
V historii byla pozorována přítomnost cirkulujících buněk s vlastnostmi nádorových buněk v krvi pacientů s metastazujícím karcinomem již v roce 1869, avšak intenzivní výzkum probíhá až v posledních 15 letech. Izolace CTCs metodou imunomagnetické separace následovaná RT-PCR je dlouhodobě používanou a respektovanou technikou. Současné video ukazuje izolaci CTCs, izolaci mRNA z CTCs a reverzní transkripci (RT), což umožňuje získat cDNA a detekovat exprese nádorově souvisejících genů HER-2, MUC1 a EpCAM.
Přítomnost CTCs je spojena s prognózou nádoru; snížení počtu CTCs po chemoterapii koreluje s odpovědí na léčbu. Detekce probíhá imunomagnetickou separací následovanou RT-PCR; postupy zajišťují kvalitu vzorků a potvrzení přítomnosti exprese nádorových genů.
Praktické ukázky a souvislosti s FFPE vzorky
V současnosti se používají FFPE vzorky pro analýzu DNA a RNA i přes jejich původní určení, s tím, že řezy mohou být vybrány z hematoxylin-eosinových preparátů a deparafinizovány před izolací NA. Prvotní kroky zahrnují vyřezávání vrstev, odstranění OM a zvolení oblastí s vyšším potenciálem pro získání kvalitních nukleových kyselin. Kvalita izolované DNA z FFPE tkání bývá nižší, proto se často volí krátké amplicony a specializované protokoly navržené pro degradované vzorky.
Venujeme se i popisu různých nosičů a reagencií, které umožňují efektivní izolaci DNA v zátěži různých vstupních materiálů, a to zejména magnetické mikročástice, které umožňují rychlou a čistou izolaci s minimální kontaminací. Příklady zahrnují použití magnetického silicagelu, P(HEMA-co-GMA) nosičů a dalších nosičů pro konjugaci DNA a jejich použití v různých vzorcích.
Souhrnné poznámky k metodám a praktickým doporučením
- Izolace DNA a RNA z FFPE tkání je možná, ale vyžaduje speciální přístupy kvůli fragmentaci a degradaci NA.
- Deparafinace a správná příprava řezů zvyšují šanci na úspěch izolace.
- Magnetická separace a automatizované systémy zvyšují reproduibilitu a snižují kontaminaci.
- RNA z FFPE bývá fragmentovaná; pro RT a PCR je často nutné cílit na krátké amplicony.
- Cirkulující nádorové buňky představují důležitý biomarker pro prognózu a hodnocení odpovědi na terapii.
Příprava tkáně a vlastní izolace DNA
Příprava tkáně a vlastní izolace DNA
Instruktážní materiály a popsané metody mají praktické uplatnění jak v klinické diagnostice, tak ve výzkumu, kde lze využít staré archivační vzorky pro genetickou analýzu, díky čemuž lze získat cenné genotypické informace z materiálu, který by jinak nebyl dostupný.
| Krok izolace | Materiály | |
|---|---|---|
| Příprava řezů | Řezání, odstranění oxidované vrstvy | Mikrotom, hematoxylin-eosin preparáty |
| Depparafinace | Odbourání parafínu | standardní deparafinace roztoky |
| Uvolnění NA | Buněčné šroubovice a uvolnění NA | chemické reagencie podle protokolu |
| Purifikace | Odstředění a vyvázání NA | magnetické nosiče, silikagel) |
| Eluace | Rozpuštění NA v elučním pufru | pufry a buffer pro DNA/RNA |
tags: #izolace #nukleovych #kyselin #ze #tkani