Krevní nátěr je mikroskopický preparát sloužící k vyšetření krevního obrazu. Nejprve použijeme dezinfekci pro očištění místa odběru. Následně odebíráme krev z bříška prstu nebo laterálního boku třetího nebo čtvrtého prstu nedominantní ruky, u dětí z paty či ušního lalůčku. První kapku, která se objeví, stíráme sterilním tamponkem z důvodu možného obsahu tkáňového moku. Druhou kapku krve již nanášíme na odmaštěné podložní sklíčko. Kapku umístíme na jednu stranu podložního skla (např. napravo) a druhým sklíčkem se pomalým pohybem přibližujeme ke kapce z druhé (levé) strany. Jakmile se sklo dotkne kapky, krev se kapilaritou rozprostře podél celé hrany. Plynulým pohybem rozetřeme krev v tenké vrstvě po podložním skle ve směru od kapky. Jedná se o tradiční metodu barvení krve tzv. Metodu provádíme ve vodorovné poloze tak, aby nátěr obsahoval jednu vrstvu buněk. Následuje oplach destilovanou vodou a usušení. Při prohlížení pod mikroskopem používáme imerzní objektiv a imerzní olej. Pro potřebu fixace používáme roztok May-Grünwaldův. Zaschlý nátěr se pokape koncentrovaným May-Grünwaldovým roztokem na 3-5 min. Poté necháme zafixovaný a obravený krevní nátěr zaschnout a prohlížíme ho za pomoci imerzního objektivu (nekryjeme krycím sklíčkem).
Klasifikace a morfologie krevních elementů
Červené krvinky jsou terminálně diferencované bezjaderné bikonkávní elementy vyplněné hemoglobinem, který přenáší kyslík. V cirkulaci krve přežívají cca 120 dní, poté jsou odstraněny makrofágy. Bílé krvinky jsou krevní elementy, které opouštějí krevní řečiště a vstupují do tkání, kde vykonávají svou hlavní funkci, tzn. v obraně organismu. Název leukocyty je nesmírně široký, proto rozlišujeme leukocyty do dvou skupin na tzv. Zralé neutrofilní leukocyty tvoří 50-70 % cirkulujících leukocytů. V krevním řečišti jsou inaktivní, nicméně jsou to obvykle první leukocyty, které se objeví na místě infekce. Tam na základě chemotaxe fagocytují bakteriální buňky a jejich zbytky. Eosinofily jsou ve srovnání s neutrofily daleko méně početné a představují jen 1-4 % leukocytů. V krevních nátěrech jsou to buňky stejně velké nebo nepatrně větší než neutrofily, avšak mají dvousegmentované jádro. Dalším rozdílem pak jsou veliká acidofilní granula (růžová až červená). Bazofily tvoří méně než 1 % cirkulujících leukocytů, proto je velice obtížné jej na krevním nátěru nalézt. Jádro bazofila bývá rozděleneé na dva laloky, které jsou nepravidelného tvaru a obsahují specifická granula. Tato granula mají oproti zbylým leukocytům méně pravidelný tvar, barví se bazicky (obvykle purpurově až modročerně). Lymfocyty jsou buňky s kulatými jádry a jsou nejčastějším typem agranulocytů v krevním nátěru. Jedná se o nejmenší typ leukocytu a tvoří přibližně 30 % všech leukocytů. Přestože je to nejmenší typ leukocytu, je nesmírně důležitý, protože sehrává hlavní funkci imunitní odpovědi. Zralé lymfocyty dělíme do několika funkčně odlišných skupin dle svých povrchových molekul. Hlavní třídy lymfocytů zahrnují B-lymfocyty (pomocné), T-lymfocyty (cytotoxické) a tzv. NK buňky (z anglického natural killer cells). V porovnání s ostatními leukocyty vykazují výrazné odchylky ve velikosti. Monocyty patří též do skupiny agranulocytů. Jsou to prekurzory dalších nesmírně důležitých buněk, a to makrofágů, osteoklastů, mikroglií a dalších buněk mononukleárního fagocytárního systému. Buňky pocházející z monocytů jsou buňky prezentující antigen a hrají velice důležitou roli v imunitní obraně tkání. Cirkulující monocyty obvykle žijí velice krátce, v tkáních žijí až měsíce. Trombocyty, tedy krevní destičky, jsou bezjaderné krevní elementy, které sehrávají nezastupitelnou funkci při hemostáze (zástavě krvácení). Vznikají z megakaryocytů v kostní dřeni a nejsou to samotné buňky, ale fragmenty cytoplazmy megakaryocytů. Z jednoho megakaryocytu vznikne až 5000 fragmentů, tzn. krevních destiček. V cirkulaci žijí 9-12 dní, obvykle zanikají v endotelu cévy.
Leukocyty a jejich význam v nátěrech
Zvláště důležité je rozlišovat jednotlivé typy leukocytů podle tvaru jádra a barvivosti. Eosinofily mají dvousegmentované jádro a velká acidofilní (růžová až červená) granulárnost. Bazofily mají typické dvojlaločnaté jádro a specifická granula, která se barví bazicky. Lymfocyty vykazují různorodé povrchové molekuly a jejich hlavní funkcí je buněčně zprostředkovaná imunita. Monocyty jsou předchůdci makrofágů a dalších buněk a jejich prezentace antigenu hraje klíčovou roli v imunitní obraně tkání.
V souvislosti s histologickým záznamem je nutné zmínit, že existují i přístroje pro poloautomatické barvení krevních nátěrů, které umožňují zpracovat značný počet sklíček za hodinu a zajistit reprodukovatelnou kvalitu. Například poloautomat pro barvení krevních nátěrů s až 60-120 sklíčky za hodinu a nastavitelnými protokoly poskytuje standardizované výsledky. Kontinuální vývoj zahrnuje vodní a alkalické lázně, které ovlivňují kvalitu barvení eosinem a hematoxylinem, a je důležité sledovat pH roztoku eosinu pro optimální zbarvení.
Praktické poznámky k přípravě a hodnocení
- Skla musí být čistá, odmaštěná a suchá, kapka krve by měla být nanesena s vhodnou šířkou roztěru a pod správným úhlem, obvykle 45° až 30°.
- Po nanesení kapky se barvení provádí směrem od kapky do okraje skla a nátěr se roztírá v tenké vrstvě.
- Nátěr se nechá zaschnout a poté se provede fixace May-Grünwaldovým roztokem na 3-5 minut.
- Pro prohlížení se používá imerzní olej a imerzní objektiv; krycí sklíčko se nepokrývá v některých protokolech, aby se zachovala specifická struktura nátěru.
- Prakticky důležité je sledovat kvalitu barvení a čistotu roztoků, včetně záměrného monitorování pH eosinu, aby nedocházelo k nesprávnému zbarvení jader či cytoplazmatických struktur.
